2017年12月4日，硕士研究生于作琛同学和郑远迪同学在组会上做了文献报告，具体内容如下：
报告人：于作琛报告题目：Structural and electronic determinants of lyticpolysaccharide monooxygenase reactivity on polysaccharide substrates
主要内容：本文作者在晶体结构解析的基础上对LsAA9A和CvAA9A进行了对比研究。发现两者均能氧化裂解多种底物，但LsAA9A可降解木糖类底物，而CvAA9A不能。经过主要三个步骤的研究：通过不同结构的底物，判断LPMO的底物裂解模式；用酶和多种底物的共结晶进行分析；用EPR分析酶和多种底物结合时活性中心附近的结合特点，解释了两个LPMO不同的催化机制。
图1：对LsAA9A，CvAA9A，TaAA9A进行序列相似性分析。A中，LsAA9A和CvAA9A为Type3的AA9家族LPMO，相似性较高，TaAA9A为Type1的AA9家族LPMO，与PaLPMO9A相似性较高。B中，用LsAA9A，CvAA9A，TaAA9A氧化纤维六糖，发现前两者的产物较为相似。
图2，比较LsAA9A与CvAA9A降解不同底物的区别。LsAA9A，CvAA9A均能降解纤维素，葡聚糖（MLG，含β-1,3和β-1,4两种连接方式），葡甘露聚糖和木葡聚糖。LsAA9A能降解木聚糖，CvAA9A对木聚糖的降解效果不明显。
图3，以MLG为例说明LsAA9A与CvAA9A氧化降解产物中同时含有C1，C4位氧化产物，且偏好MLG中四糖的区域。
图4，不同的电子供体对LsAA9A氧化不同底物时的影响。A中，LsAA9A氧化裂解MLG，葡甘露聚糖，木葡聚糖时，用抗坏血酸效果较优。用木聚糖为底物时，两种电子供体效果无明显差异。B中，用纤维六糖和木六糖为底物验证了这种差异。
图5，LsAA9A与纤维五糖和葡甘露聚糖结合的晶体结构分析。
图6，分析LsAA9A与木寡糖底物结合的晶体结构，并分析其与其他底物结合的结构的区别。发现，两者位置相差半个六元环，使得+1位的糖与酶没有结合，且中间增加了一个水分子的位置。
图7：用EPR检测LPMO与不同底物结合时，铜离子活性中心附近电子的变化。红色的线表示LPMO与纤维六糖的结合，gz从2.25左右偏移至2.23左右；蓝色的线表示LPMO与木聚糖的结合，并无这种变化，验证了图6中的结论。
报告人：郑远迪 报告题目: One pot synthesis of GDP-mannose by a multi-enzyme cascade forenzymatic assembly of lipid-linked oligosaccharides
报告内容: 由五种酶，葡萄糖激酶（Glk），磷酸甘露糖转移酶（ManB），甘露糖-1-磷酸 - 鸟嘌呤转移酶（ManC），无机焦磷酸酶（PmPpA）和1-结构域多磷酸激酶2（1D-Ppk2）在大肠杆菌中表达，用于从甘露糖和多磷酸盐生产和再生具有催化量的GDP和ADP的GDP-甘露糖。另外，将级联与纯化的跨膜缺失的Alg1（ALG1ΔTM）偶联，ERG1ΔTM是与ER相关的脂质连接的寡糖（LLO）组件中的第一个甘露糖基转移酶。因此，在一锅反应中，首次生产具有有效核苷酸糖再生的植烷基-PP-（GlcNAc）2-Man1。 Phytanyl-PP-（GlcNAc）2-Man1可以作为LLO合成的底物，用于蛋白质的无细胞体外糖基化。优化并验证了具有UV和电导率检测（HPAECUV / CD）测定法的高效阴离子交换层析方法以确定酶动力学。建立的动力学模型能够优化GDP-甘露糖再生级联，并可进一步用于研究GDP甘露糖级联与糖基转移酶的偶联。
图1在大肠杆菌中表达的来自不同微生物的酶的工程化体外GDP-甘露糖途径：葡萄糖激酶（His6-Glk），磷酸甘露糖转移酶（ManB-His6）和甘露糖-1-磷酸乙酰转移酶（ManC），无机焦磷酸酶（PmPpA-His6），1 - 多聚磷酸激酶2（His6-1D-Ppk2）与s-1,4-甘露糖基转移酶（Alg1ΔTM）体外偶联，用于生产具有GDP-甘露糖再生的植烷基-PP-（GlcNAc）2-Man1。
图2a用于开发和优化的洗脱（KOH）梯度的170μM标准样品的UV-色谱图。用于检测的紫外线波长为260nm。 ADP，GDP-甘露糖，ATP，GDP和GTP浓度通过紫外线信号进行定量。测定验证。
图2b用于开发和优化的洗脱（KOH）梯度的170μM标准样品的电导色谱图。通过电子再生抑制剂ERS500从Dionex进行氢氧根离子的抑制。 5分钟的大峰由Cl-离子引起。 Man1P，man6P，磷酸盐（P）和二磷酸盐（DP）浓度通过电导率检测进行测定验证。
图3分析用于GDP-甘露糖再生循环的酶的纯度（SDS-PAGE，考马斯染色）。纯化蛋白的浓度为0.4-0.7mg / mL。泳道1 - 分子量标记（PageRulerTM Unstained Low Range Protein Ladder，ThermoFisher Scientific，Schwerte.
图4a使用不同甘露糖浓度的ATP（1.7mM），通过His6-Glk（1mg / mL）合成不可逆的man6P。线条代表了模型。
图4bManB-His6 / ManC（0.171mg / mL）复合物的反向反应：将甘露糖和焦磷酸盐转化为ManB和ManC催化的GTP和man6P。随后，GDP-人的合成在很大程度上取决于焦磷酸盐向磷酸盐的转化。描绘的拟合符合His6-Glk和ManB-His6 / ManC分别为催化反应的整个数据集。
图5a通过His6-1D-Ppk2（0.05 mg / mL）的ADP和GDP的磷酸化：具有不同初始PolyP14浓度的ATP浓度分布（ADP，GDP和GTP未显示）。起始浓度为0.2mM ADP，0.2mM GDP和各种PolyP14浓度。（见图例）。 线代表基于质量动力学的模型。 不可能获得简单的动力学速率定律来模拟高浓度和低浓度的PolyP14的反应抑制。
图5b在研究条件下，ADP和GDP的磷酸化反应彼此独立。起始浓度：蓝色交叉：0.15mM ADP对蓝色圆圈：0.15mM ADP，0.5mM GDP; 绿色交叉：0.15mM GDP对绿色三角形：0.15mM GDP，0.5mM ADP。线代表从模拟获得的GTP（绿色）和ATP（蓝色）的浓度。根据质量平衡，150μM分别是最高的GTP和ATP浓度。描绘的拟合符合His6-1D-Ppk2催化反应的整个数据集。
图6a从甘露糖，ADP，GDP和PolyP14 - 实验（点）和模拟数据（线）开始生产GDP-甘露糖的级联反应。
图7从甘露糖，ADP，GDP和PolyP14开始的级联反应的GDP-甘露糖浓度随时间推移。（A）具有各种初始浓度的k4，opt（线）的实验数据（点）和建模数据; （B）pH值为7.0,7.5和8.0的反应的GDP-甘露糖浓度; （C）在25℃，30℃和35℃下反应的GDP甘汞浓度; （D）MgCl2浓度为5,10和20mM的GDP-甘露糖浓度。所描绘的拟合符合多酶催化反应的整个数据集。
图8GDP-甘露糖级联与Alg1ΔTM结合产生具有连续再生GDP-甘露糖的植烷基-PP-（GlcNAc）2-Man1（Man1）。 实验数据（点）和模拟数据（线）。
结论:设计了从大肠杆菌BL21-Gold（DE3）中表达和纯化的五种酶的无细胞级联，以产生并再生具有催化量的GDP和ADP的甘露糖和多磷酸的GDP-甘露糖。 GDP-甘露糖的最大反应速率在30℃下为2.7μM/ min，10mM MgCl 2在240分钟后从800nmol GDP和6μmol甘露糖产生566nmol GDP-甘露糖。此外，已经证明，级联可以与纯化的糖基转移酶体外偶联以向LLO组合中提供甘露糖。建立了基于单酶反应的动力学模型，以研究多酶级联的抑制和增强。该模型可用于研究和优化GDP-甘露糖级联与一种或多种糖基转移酶的偶联。总体而言，该研究设想了开发无细胞生产LLO作为蛋白质体外糖工程前体的平台的第一步。
