1805组Journal Club简报(2018-06-20)
1805组Journal Club简报(2018-06-20)
发布时间:2018-07-09 09:06    栏目类别:组内生活

 2018年6月19日,博士研究生杨国军和硕士研究生巩凤芹同学在组会上做了文献报告,具体内容如下:

报告人:杨国军 报告题目:Metagenomicmining pectinolytic microbes and enzymes from an apple pomace-adaptedcompost microbial community

报告内容:Background: 木质纤维素材料中果胶的降解是生物燃料生产的关键步骤之一。果胶的生物水解作用,也就是产果胶酶的降解作用,由于生物降解的明显优势,如环境友好、对木质素去除的能量需求低。本研究中,使用宏基因组学序列引导策略与微生物富集培养技术相结合,以促进果胶降解微生物和酶的靶向发现。为了促进果胶分解微生物的富集,建立了一种适合苹果的堆肥(APAC)栖息地。

Results:对16S rDNA高通量测序的分析表明,微生物群落在堆肥过程中发生了显着变化,其中一些细菌群体被极大地富集。宏基因组学数据显示苹果渣改良堆肥微生物群落(APACMC)以变形杆菌(Proteobacteria)和拟杆菌为主(Bacteroidetes)。功能分析和碳水化合物活性酶特征表明:APACMC已成功富集靶向功能的果胶降解酶。在1756个推定的编码果胶分解酶的基因中,129个被预测为新的功能基因(与CAZy数据库条目的同源性< 30 %),并且在NCBI环境数据库中仅有1.92 %与其他蛋白质的同源性超过75 %,表明它们没有被在以前的宏基因组挖掘中发现。进化分析显示,APACM发现大量以前未被发现的果胶降解菌。

Conclusions:在我们的研究中发现的极其多样的果胶降解微生物和酶将扩大木质纤维素生物燃料生产的所需降解物和酶的库存。本研究方法为在众多行业中有针对性地挖掘微生物和酶提供了强有力的实验方法。

1. 宏基因组学挖掘来自苹果渣改良堆肥微生物群落降解果胶的微生物和酶的实验路线图


2. APACMC30天的实验阶段,APACMC理化指标的变化(ab:堆肥的温度、pH和水含量的变化);堆肥不同时期菌群落的动态变化(c, 菌落门水平变化; d, 菌落属水平变化)


3. 分类学分析显示APACMC主要由变形门杆菌,拟杆菌属,放线菌属和厚壁菌门组成;用星号标记的(见图3b)是木质纤维素降解菌。同时,发现了许多嗜热果胶降解菌(用实心圆标记,参见图3b),包括Thermobispora bispora,Thermomonospora curvata, Thermobifida fusca。大部分木质纤维素分解和果胶分解微生物共同进一步证实APACMC具有靶向降解功能。


4. COG分类(图4a)显示,APACMC富含氨基酸代谢(所有COG功能类别为8.8 %),一般功能(8.7 %),无机离子代谢(7.9 %),碳水化合物转运和代谢(7.1 %)能量产生和转换(6.6 %)以及细胞壁//包膜生物发生(6.1 %);KEGG展示了类似的模式(图4b),其中碳水化合物代谢(17.0 %),氨基酸代谢(16.0 %),能量代谢(9.4 %),核苷酸代谢(6.6 %)和膜运输(6.2 %)。表明APACMC已经成功富集了几种期望的功能能力,特别是对于碳水化合物代谢。


5. 图6描述了不同类型的果胶分解酶及其切割位点。果胶的降解是由甲氧基的脱酯作用引起的,影响了细胞壁的质地和硬度。果胶甲酯酶(PMEs,EC 3.1.1.11)从HG骨架上除去甲基以获得去聚合酶,而果胶乙酰酯酶(PAEs,EC 3.1.1.6)从乙酰化HG和RG上去除乙酰基。水解酶(多聚半乳糖醛酸酶PGs,EC3.2.1.15,67和82)和裂解酶(果胶裂解酶:PNLs,EC4.2.2.10和果胶酸裂合酶:PELs,EC4.2.2.2和9)优先分别通过水解和β-消除来降解HG/XGA主链的α-1,4-糖苷键。同样,在最初的果胶解构中,PNLs也起着至关重要的作用,因为它是唯一可以切割高度酯化果胶的α-1,4键的酶,而无需其他酶的作用。去分支酶负责RG-I和RG-II的主链或侧链的切割。


报告人:巩凤芹  报告题目:Nano-Biocatalystsof Cyt c@ZIF-8/GO Composites with High Recyclability via a de Novo Approach

主要内容:为了提高固定在金属有机骨架(MOFs)上的酶的稳定性和可回收性,研究人员选择表面具有富氧官能团的氧化石墨烯(GO)与沸石咪唑酯骨架(ZIF-8)形成ZIF-8 / GO纳米复合材料,用于细胞色素c(Cyt c)固定。结果发现GO表面上的官能团参与ZIF-8的生长却不影响晶体结构,合成的ZIF-8粒径由原来的500nm减小到约200nm。固定在ZIF-8 / GO纳米复合材料上后,Cyt c的储存稳定性,对有机溶剂的耐受性以及操作稳定性明显提高。此外,Cyt c @ ZIF-8 / GO纳米复合材料可以使用多达4个循环,几乎不会损失活性,并且可以进一步应用于H2O2生物传感系统。ZIF-8 / GO纳米复合材料中MOFs与GO之间的协同效应为固定化酶载体提供了无限的可能性。


Cyt c @ ZIF-8 / GO纳米复合材料和合成示意图如下图所示:

1.    作者首先研究了24h内纳米复合粒子的形态变化(Figure1),在ZIF-8的前体溶液中加入0.5 wt%的GO后,ZIF-8晶体因为它们之间的毛细作用力和共价键而生长在GO层上,从而形成致密的ZIF-8层(Figure1b)。此外,GO上的ZIF-8不是单层,许多ZIF-8颗粒吸附在GO上,且GO片上负载的ZIF-8颗粒的数量随着GO含量的增加而减少,因此,随着GO含量的增加,溶液中的ZIF-8颗粒分散性明显降低。

Figure 1. FESEM images of the ZIF-8/GO nanocompositeswith different amounts of GO: (a, b) 0.5%; (c, d) 1.0%; (e, f) 1.5%; and (g, h)2.0%.

透射电子显微镜(TEM证实,纳米复合材料上的ZIF-8具有与纯ZIF-8相似的形态(Figure3a,b)。然而,它们的粒径相比纯ZIF-8(500nm)要小,约为200nm。此外,Cyt c @ ZIF-8 / GO的XRD图谱(Figure 2)表明酶的掺入并不影响ZIF-8的晶体结构。


Figure 2. XRD patterns of the nanocomposites: (a) GO;(b) 2% GOZIF-8; (c) 1% GO-ZIF-8; (d) 0.5% GO-ZIF-8; (e) 0.25% GO-ZIF-8; (f)ZIF-8; and (g) simulated XRD structure of ZIF-8

Figure3. TEM images of ZIF-8 (a,b) and ZIF-8/GO (c,d)nanocomposites.

接着,作者考察了酶的加入量以及加入时间对酶活的影响,结果表明,当蛋白加入量为5mg/mL时,酶活性最高,继续加大酶量,酶活反而降低,这是由于过量的酶堆积在载体表面,从而影响了酶与底物的接触。另外,酶加入的时间也会影响酶活,反应7h时加入蛋白,此时的蛋白吸附量和传质效果最佳,酶活性最高。


Figure 4. (a)Effect of the amount of protein added onthe activity of the immobilized enzymes. (b) Effectof the protein addition time on immobilized enzyme activities.

 3.另一方面,底物浓度也会影响酶的活性,对于游离酶来说,底物最佳浓度是0.8Mm,固定化酶的底物浓度为1Mm,这种差异是由于固定化使得酶相对分散,需要较高浓度的底物来和酶进行有效接触。比较Cyt c、Cyt c@ZIF-8、Cyt c@GO、Cyt c@ZIF-8/GO的动力学参数发现,Cyt c@ZIF-8/GO的Vmax最大,Km最小,说明固定化后的酶增加了与底物的亲和力。一些研究也表明,载体可以通过调节酶与底物的疏水作用力和底物分散性从而为酶创造合适的微环境。


Figure 5. (a) Effect of H2O2concentration on the reaction rate of free enzymes and immobilized enzymes. (b)Lineweaver-Burk curves of free enzymes and three immobilized enzymes.

4.分别将Cyt c、Cyt c@ZIF-8、Cyt c@GO、Cyt c@ZIF-8/GO在缓冲溶液中储存11天后(Figure 6a),Cyt c @ ZIF-8和Cyt c @ GO的活性值分别下降35和55%,而Cyt c @ ZIF-8 / GO的活性几乎保持不变。图(d)也证明了Cyt c @ ZIF-8 / GO复合材料具有良好的储存稳定性。Cyt c @ ZIF-8和Cyt c @ GO的蛋白质泄漏率分别为30和60%,但Cyt c @ ZIF-8 / GO的蛋白质泄漏率可以忽略不计。图(b)说明了Cyt c @ ZIF-8 / GO对有机溶剂具有很好的耐受性,而游离酶在有机溶剂中几乎完全失活。另外,Cyt c@ZIF-8/GO可以重复利用4次保持活性基本稳定。


Figure 6. (a) Storage stability ofimmobilized enzymes; (b) tolerance of organic solvents for free and immobilizedenzymes; (c) reusability curves of immobilized enzymes; and (d) enzyme sheddingcurves of immobilized enzymes.

以上研究表明,ZIF-8/ GO纳米复合材料在酶的固定化过程中表现出优异的稳定性、有机溶剂耐受性,相比于ZIF-8 或者GO单独固定化酶效果更好,这种固定化材料在生物技术和生物医学领域具有广阔的应用前景。


 
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