1805组Journal Club简报(2017-12-04)
1805组Journal Club简报(2017-12-04)
发布时间:2017-12-11 11:13    栏目类别:组内生活

    2017年12月4日,硕士研究生于作琛同学和郑远迪同学在组会上做了文献报告,具体内容如下:

        报告人:于作琛 报告题目:Structural and electronic determinants of lyticpolysaccharide monooxygenase reactivity on polysaccharide substrates

        主要内容:本文作者在晶体结构解析的基础上对LsAA9A和CvAA9A进行了对比研究。发现两者均能氧化裂解多种底物,但LsAA9A可降解木糖类底物,而CvAA9A不能。经过主要三个步骤的研究:通过不同结构的底物,判断LPMO的底物裂解模式;用酶和多种底物的共结晶进行分析;用EPR分析酶和多种底物结合时活性中心附近的结合特点,解释了两个LPMO不同的催化机制。


图1:对LsAA9A,CvAA9A,TaAA9A进行序列相似性分析。A中,LsAA9A和CvAA9A为Type3的AA9家族LPMO,相似性较高,TaAA9A为Type1的AA9家族LPMO,与PaLPMO9A相似性较高。B中,用LsAA9A,CvAA9A,TaAA9A氧化纤维六糖,发现前两者的产物较为相似。


图2,比较LsAA9A与CvAA9A降解不同底物的区别。LsAA9A,CvAA9A均能降解纤维素,葡聚糖(MLG,含β-1,3和β-1,4两种连接方式),葡甘露聚糖和木葡聚糖。LsAA9A能降解木聚糖,CvAA9A对木聚糖的降解效果不明显。


图3,以MLG为例说明LsAA9A与CvAA9A氧化降解产物中同时含有C1,C4位氧化产物,且偏好MLG中四糖的区域。


图4,不同的电子供体对LsAA9A氧化不同底物时的影响。A中,LsAA9A氧化裂解MLG,葡甘露聚糖,木葡聚糖时,用抗坏血酸效果较优。用木聚糖为底物时,两种电子供体效果无明显差异。B中,用纤维六糖和木六糖为底物验证了这种差异。


图5,LsAA9A与纤维五糖和葡甘露聚糖结合的晶体结构分析。


图6,分析LsAA9A与木寡糖底物结合的晶体结构,并分析其与其他底物结合的结构的区别。发现,两者位置相差半个六元环,使得+1位的糖与酶没有结合,且中间增加了一个水分子的位置。


图7:用EPR检测LPMO与不同底物结合时,铜离子活性中心附近电子的变化。红色的线表示LPMO与纤维六糖的结合,gz从2.25左右偏移至2.23左右;蓝色的线表示LPMO与木聚糖的结合,并无这种变化,验证了图6中的结论。

        报告人:郑远迪 报告题目: One pot synthesis of GDP-mannose by a multi-enzyme cascade forenzymatic assembly of lipid-linked oligosaccharides

        报告内容: 由五种酶,葡萄糖激酶(Glk),磷酸甘露糖转移酶(ManB),甘露糖-1-磷酸 - 鸟嘌呤转移酶(ManC),无机焦磷酸酶(PmPpA)和1-结构域多磷酸激酶2(1D-Ppk2)在大肠杆菌中表达,用于从甘露糖和多磷酸盐生产和再生具有催化量的GDP和ADP的GDP-甘露糖。另外,将级联与纯化的跨膜缺失的Alg1(ALG1ΔTM)偶联,ERG1ΔTM是与ER相关的脂质连接的寡糖(LLO)组件中的第一个甘露糖基转移酶。因此,在一锅反应中,首次生产具有有效核苷酸糖再生的植烷基-PP-(GlcNAc)2-Man1。 Phytanyl-PP-(GlcNAc)2-Man1可以作为LLO合成的底物,用于蛋白质的无细胞体外糖基化。优化并验证了具有UV和电导率检测(HPAECUV / CD)测定法的高效阴离子交换层析方法以确定酶动力学。建立的动力学模型能够优化GDP-甘露糖再生级联,并可进一步用于研究GDP甘露糖级联与糖基转移酶的偶联。


图1在大肠杆菌中表达的来自不同微生物的酶的工程化体外GDP-甘露糖途径:葡萄糖激酶(His6-Glk),磷酸甘露糖转移酶(ManB-His6)和甘露糖-1-磷酸乙酰转移酶(ManC),无机焦磷酸酶(PmPpA-His6),1 - 多聚磷酸激酶2(His6-1D-Ppk2)与s-1,4-甘露糖基转移酶(Alg1ΔTM)体外偶联,用于生产具有GDP-甘露糖再生的植烷基-PP-(GlcNAc)2-Man1。


图2a用于开发和优化的洗脱(KOH)梯度的170μM标准样品的UV-色谱图。用于检测的紫外线波长为260nm。 ADP,GDP-甘露糖,ATP,GDP和GTP浓度通过紫外线信号进行定量。测定验证。

图2b用于开发和优化的洗脱(KOH)梯度的170μM标准样品的电导色谱图。通过电子再生抑制剂ERS500从Dionex进行氢氧根离子的抑制。 5分钟的大峰由Cl-离子引起。 Man1P,man6P,磷酸盐(P)和二磷酸盐(DP)浓度通过电导率检测进行测定验证。


图3分析用于GDP-甘露糖再生循环的酶的纯度(SDS-PAGE,考马斯染色)。纯化蛋白的浓度为0.4-0.7mg / mL。泳道1 - 分子量标记(PageRulerTM Unstained Low Range Protein Ladder,ThermoFisher Scientific,Schwerte.


图4a使用不同甘露糖浓度的ATP(1.7mM),通过His6-Glk(1mg / mL)合成不可逆的man6P。线条代表了模型。

图4bManB-His6 / ManC(0.171mg / mL)复合物的反向反应:将甘露糖和焦磷酸盐转化为ManB和ManC催化的GTP和man6P。随后,GDP-人的合成在很大程度上取决于焦磷酸盐向磷酸盐的转化。描绘的拟合符合His6-Glk和ManB-His6 / ManC分别为催化反应的整个数据集。


图5a通过His6-1D-Ppk2(0.05 mg / mL)的ADP和GDP的磷酸化:具有不同初始PolyP14浓度的ATP浓度分布(ADP,GDP和GTP未显示)。起始浓度为0.2mM ADP,0.2mM GDP和各种PolyP14浓度。(见图例)。 线代表基于质量动力学的模型。 不可能获得简单的动力学速率定律来模拟高浓度和低浓度的PolyP14的反应抑制。

图5b在研究条件下,ADP和GDP的磷酸化反应彼此独立。起始浓度:蓝色交叉:0.15mM ADP对蓝色圆圈:0.15mM ADP,0.5mM GDP; 绿色交叉:0.15mM GDP对绿色三角形:0.15mM GDP,0.5mM ADP。线代表从模拟获得的GTP(绿色)和ATP(蓝色)的浓度。根据质量平衡,150μM分别是最高的GTP和ATP浓度。描绘的拟合符合His6-1D-Ppk2催化反应的整个数据集。


图6a从甘露糖,ADP,GDP和PolyP14 - 实验(点)和模拟数据(线)开始生产GDP-甘露糖的级联反应。


图7从甘露糖,ADP,GDP和PolyP14开始的级联反应的GDP-甘露糖浓度随时间推移。(A)具有各种初始浓度的k4,opt(线)的实验数据(点)和建模数据; (B)pH值为7.0,7.5和8.0的反应的GDP-甘露糖浓度; (C)在25℃,30℃和35℃下反应的GDP甘汞浓度; (D)MgCl2浓度为5,10和20mM的GDP-甘露糖浓度。所描绘的拟合符合多酶催化反应的整个数据集。


图8GDP-甘露糖级联与Alg1ΔTM结合产生具有连续再生GDP-甘露糖的植烷基-PP-(GlcNAc)2-Man1(Man1)。 实验数据(点)和模拟数据(线)。


       结论:设计了从大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中表达和纯化的五种酶的无细胞级联,以产生并再生具有催化量的GDP和ADP的甘露糖和多磷酸的GDP-甘露糖。 GDP-甘露糖的最大反应速率在30℃下为2.7μM/ min,10mM MgCl 2在240分钟后从800nmol GDP和6μmol甘露糖产生566nmol GDP-甘露糖。此外,已经证明,级联可以与纯化的糖基转移酶体外偶联以向LLO组合中提供甘露糖。建立了基于单酶反应的动力学模型,以研究多酶级联的抑制和增强。该模型可用于研究和优化GDP-甘露糖级联与一种或多种糖基转移酶的偶联。总体而言,该研究设想了开发无细胞生产LLO作为蛋白质体外糖工程前体的平台的第一步。



 
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