1805组Journal Club简报(2017-11-06)
1805组Journal Club简报(2017-11-06)
发布时间:2017-11-08 09:51    栏目类别:组内生活

       2017年11月06日,硕士研究生朱先玉和张宁宁同学在组会上做了文献报告,具体内容如下:

        报告人:朱先玉 报告题目:Identification of Key Residues Modulating the Stereoselectivity of Nitrile Hydratase towards rac-Mandelonitrile by Semi-rational Engineering†

        报告内容:Nitrile Hydratase是一类用于从腈生产高价值酰胺的金属酶。 腈及其相应的酰胺类化合物在药物和化学工业中有广泛的应用,特别是手性产品的纯对映体。纯的手性化合物在精细化学品的合成中是重要的。使用酶的定向进化能够获得能够选择性生产高价值手性化学品,但是仅仅基于结构数据和对接实验的传统半合理设计会因为缺乏关键氨基酸的准确选择而受到限制。 在这项研究中,通过基于导向分子动力学模拟的配体 - 蛋白质碰撞计数,准确地确定了与改性腈水解酶立体选择性相关关键氨基酸。结合导向分子动力学模拟与传统的半合理设计相结合,显着降低了NHase立体选择性相关的关键氨基酸的选择范围,可作为酶立体选择性调节的替代方法。

        a.用NHase立体选择性水解rac-mandelonitrile 来生产(S)- mandelamide

         b.增强立体选择性所选择的突变位点

        c.野生型NHase的底物结合口袋和底物结合通道

         d.S-MANR-MAN在导向分子动力学中的路径

        e.通过HPLC分析野生型和突变体的NHaserac-MAN的立体选择性

        f.野生型和F37H突变株对R-MANS-MAN立体选择性参数的测定

         结论:通过同源建模,分子对接及导向分子动力学准确地确定了与改性腈水解酶立体选择性相关的关键氨基酸。结合导向分子动力学模拟与传统的半合理设计相结合,显着降低了NHase立体选择性相关的关键氨基酸的选择范围,可作为酶立体选择性调节的替代方法。为工业化生产纯手型化合物提供了帮助。

 

         报告人:张宁宁报告题目:Heterologous expression and characterization of functional mushroom tyrosinase (AbPPO4)

        报告内容:酪氨酸酶是一种无处不在的含铜金属酶,能氧化酚类分子。在应用领域中,术语“酪氨酸酶”通常是指“蘑菇酪氨酸酶”由同工酶的混合物组成并含有许多副酶促作用。此篇文章建立了一种有效的在大肠杆菌中异源表达双孢蘑菇中酪氨酸酶(APPO4)的方法。

图1.克隆表达全长AbPPO4序列。灰色: 载体上序列; 蓝色: 主要区域,包括铜离子协调的组氨酸 (红色);黄色: C80H82形成巯醚键; 橙色: C-末端区域; 绿色: CXXC-序列包含此酶的所有的自由的半胱氨酸;

图2.四个纯化阶段的SDS-PAGE电泳图. L: 粗酶, F: 一次流穿液, P: 不溶的细胞沉淀, M:

AC: 一次洗脱液, l: 潜在的AbPPO4, a: 活化的 AbPPO4

图3. 离子活化剂对潜在酪氨酸酶的活化。

图4.天然来源的和重组AbPPO4的空间结构比对。

图5.酶活随pH变化

       应用这种方法制备单一的潜在的酪氨酸酶可以达到每升140mg的产量。这种重组蛋白具有与从天然来源纯化的酶相同的折叠。潜在的酪氨酸酶可以通过蛋白酶K切割K382后的多肽链后活化。可以在反应混合物中加入离子型活化剂诱导酶活性。酪氨酸酶在pH510范围内显示其最大活性的50%以上,并且可以催化的底物范围广,包括单酚和二酚,黄酮醇和查耳酮。

 

 
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